На ферменті з мембран еритроцитів було виявлено, що уявна спорідненість ферменту до Са2+ значно збільшувалась у присутності кальмодуліну при високій концентрації Mg2+ і менш реагувала на кальмодулін при низькій концентрації цього катіону (менше2 мМ). Найвища уявна спорідненість до Са2+ спостерігалась при рН 8,0 в присутності чи у відсутності кальмодуліну і прогресивно зменшувалась при наближенні до рН 6,0.
Уявна спорідненість Са2+-транспортуючої АТРази мембран еритроцитів до кальмодуліну є досить високою: К0,5 по кальмодуліну становила біля 6 нМ незалежно від концентрації Mg2+. К0,5 по кальмодуліну Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран гладеньком’язових клітин шлунку складала 27,0 нМ.
Для очищеного ферменту з мембран еритроцитів показана наявність двох КМ по MgATP: високої спорідненості та низької, що дорівнювали відповідно 7 та 140 мкМ. При мілімолярних концентраціях вільного Mg2+, перевищуючих концентрацію АТР, активність ферменту гальмувалась.
Після перевірки в якості субстратів очищеної Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран клітин міометрію АТР, GTP, UTP, CTP, було показано, що фермент є строго специфічним відносно субстрату та гідролізує виключно молекулу АТР.
Виявлено, що оптимум рН для Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран кардіоміоцитів 7,3, мембран еритроцитів – 7,0 – 7,25. Оптимальним для роботи очищеної Са2+, Mg2+- АТРази сарколеми міометрію є рН 7,5 – 8,0, в той час як для мембранної її форми оптимум рН знаходиться в діапазоні 6,4 – 7,0.
Температурний оптимум для очищеної Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран еритроцитів спостерігався при 37 – 41 ОС, для Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран клітин міометрію – при 40 – 45 ОС. Підвищення температури до 50 ОС призводило до значного зниження активності очищеного ферменту.
Регуляція ферменту внутрішньоклітинними факторами та фізіологічно активними речовинами.
Виконуючи в клітинах роль регуляторної системи концентрації іонів Са2+, Са2+, Mg2+- АТРаза плазматичних мембран сама є мішенню для дії великої кількості регуляторів. ЇЇ активність та спорідненість до Са2+ можуть значно моделюватися багатьма білковими та небілковими факторами - кальмодуліном, кислими фосфоліпідами плазматичних мембран, двохвалентними іонами, сАМР-залежною протеінкіназою та протеінкіназою С, процесом обмеженого протеолізу.
Регуляція Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран кальмодуліном.Перші відомості про регуляцію Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран кальмодуліном були отримані на початку 70-х років Бондом та Клау. В своїй роботі вченими було показано, що для переведення ферменту з менш активної форми А в більш активну форму В було необхідним додавання до виділених мембран не лише іонів Са2+ для моделювання реакції накопичення іонів Са2+, а також внутрішньоклітинного вмісту, який, напевно, містив “фактор активації”. Пізніше цей фактор було виділено, охарактеризовано та названо кальмодуліном.
Кальмодулін - це невеликий термостабільний білок, що представлений одним поліпептидним ланцюгом молекулярною вагою 16,7 кДа. Цей білок є дуже консервативним: його амінокислотна послідовність є практично повністю ідентичною в ряду від безхребетних до вищих ссавців та людини. Така еволюційна консервативність є свідоцтвом виключно важливої ролі кальмодуліна як регулятора багатьох ферментних систем живих організмів. На цей час відомо понад два десятки кальмодулінзалежних білків. Вважається, що кальмодулін є універсальним регулятором більшості Са2+-залежних ферментів, але лише для Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран показана пряма регуляція кальмодуліном її активності через безпосередню взаємодію ферменту та активатора. Взаємодія Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран з кальмодуліном призводить до підвищення спорідненості системи до іонів Са2+ (у присутності кальмодуліна К0,5 для Са2+ = 0,5 мкМ, у відсутності - КМ для Са2+ = 10 - 20 мкМ) та 10-кратного підвищення швидкості гідролізу АТР та трансмембранного перенесення Са2+. Кальмодулінзв’язуючий сегмент Са2+, Mg2+- АТРази характеризується: 1) наявністю великої кількості позитивно заряджених залишків Arg та Lys та їх переважною локалізацією на N-кінцевій ділянці сегмента; 2) переважанням гідрофобних залишків на С-кінцевій ділянці сегмента; 3) наявністю залишку Trp та трьох залишків Ser відповідно на N- та С-кінцевих ділянках пептида. Сам кальмодулінзв’язуючий сегмент знаходиться, як вже було зазначено вище, в С-кінцевій області ферменту.
Виходячи з подібних досліджень, було запропоновано можливий механізм взаємодії Са2+, Mg2+- АТРази з кальмодуліном: N-кінцевий сегмент кальмодулінзв’язуючого домену, збагачений залишками Arg та Lys, за відсутності кальмодуліна взаємодіє з високоафінним Са2+-зв’язуючим доменом, частково інактивуючи фермент. При додаванні кальмодуліна, активатор взаємодіє з кальмодулінзв’язуючим центром Са2+, Mg2+- АТРази, руйнуючи попередню взаємодію та вивільнюючи Са2+-зв’язуючий домен ферменту.
Регуляторний вплив на Са2+, Mg2+- АТРазу кислих фосфоліпідів плазматичних мембран. Регуляторна дія кислих фосфоліпідів на активність Са2+, Mg2+-АТРази досліджувалась на препаратах виділеного та очищеного ферменту. До очищеної Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран додавались такі негативно заряджені фосфоліпіди: фосфатидилінозитол 4,5-бісфосфат (PtdIns4,5P2), фосфатидилінозитол 4-фосфат (PtdIns4P), фосфатидилінозитол (PtdIns), фосфатидилсерін (PtdSer) та фосфатидна кислота (PtdOH). Відносна ефективність впливу перелічених фосфоліпідів на активність солюбілізованої Са2+, Mg2+- АТРази розподілилась за таким рядом: PtdIns4,5P2> PtdIns4P > PtdIns = PtdSer = PtdOH [44]. Стимулюючий ефект кислих фосфоліпідів кінетично проявляється в майже 10-кратному підвищенні швидкості реакції (Vmax) транспортування катіонів та гідролізу АТР та спорідненості ферменту до іонів Са2+. Але регуляторний вплив кислих фосфоліпідів на Са2+, Mg2+- АТРазу є більш складним, оскільки дуже високі їх концентрації призводять до відчутного зниження Vmax. Також було підтверджено експериментально, що регуляторна дія кислих фосфоліпідів проявляється як в присутності, так і у відсутності кальмодуліна. Це дозволило зробити висновок про незалежність механізмів дії кальмодуліна та кислих фосфоліпідів на Са2+, Mg2+- АТРазу та відокремленість їх регуляторних центрів в молекулі білка.
Вплив сАМР-залежної протеїнкінази та протеїнкіназои Сна активність Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран. сАМР-залежний сайт фосфорилювання Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран еритроцитів знаходиться на С-кінці поліпептидного ланцюга збагаченого залишками серіну. Процес фосфорилювання сАМР-залежною протеїнкіназою Са2+, Mg2+- АТРази плазматичних мембран призводить до підвищення її активності: К0,5 для іонів Са2+ падає з 10 мкМ до 1,4 мкМ, а Vmax процесу гідролізу АТР зростає приблизно в 2 рази. На відміну від кальмодулін незалежного впливу кислих фосфоліпідів на активність Са2+, Mg2+- АТРази процес фосфорилювання ферменту сАМР-залежною протеїнкіназою чутливий до присутності кальмодуліна: кальмодулін запобігає процесу фосфорилювання та стимуляції Са2+, Mg2+- АТРази сАМР-залежною протеїнкіназою.
Завантажити реферат