Основи генетики людини

Проте ідентифікація хромосом тіль­ки за вказаними ознаками зустрічає великі труднощі. Фактично вдається хромосома, а у межах групи визна­чити її місце і номер часто не вдаєть­ся. Згодом положення Денверської кла­сифікації були розвинуті, доповнені новими критеріями і конкретизовані на наступних міжнародних конференціях, останньою із яких була Паризька IV конференція по стандартизації хро­мосом людини (1971). Були використа­ні принципово нові методичні прийоми. У 1968—1970 рр. були опубліковані ро­боти шведського генетика Касперссона, який застосовував для вивчення хромосом флуоресцентні барвники, зок­рема акрихін — іприт і його похідні. Наступне вивчення у люмінісцентному мікроскопі показало, що хромосоми не дають рівномірного світіння по дов­жині.

Однорідність хромосом, яку спосте­рігали при використанні звичайних ядерних барвників, не підтвердилась, у них виділяється кілька яскравих смуг, які співпадають з локалізацією структурного гетерохроматину. Крім великих, дуже флуоресціюючих діля­нок, кожна хромосома має диски, які чергуються. Цей малюнок світіння строго специфічний для кожної хромо­соми. Після видалення із хромосом ДНК вони втрачають майже повністю здатність до флуоресценції. При ви­вченні каріотипу багатьох видів ссавців з'ясувалось, що здатністю до акрихі-нової флуоресценції характеризуються хромосоми людини, горили і шимпанзе. У інтерфазних ядрах цим методом ви­являється У-хромосома, яка має вигляд зеленуватого тільця, яке яскраво сві­титься.

На сьогодні розроблено кілька ме­тодів виявлення структурної неоднорід­ності по довжині хромосом людини. Основу всіх методів складають дена­турації і ренатурації ДНК хромосом, які відбулися на препаратах. Якщо після денатурації ДНК (викликаної одним із факторів) згодом провести її ренатурацію — відновлення вихідної двониткової структури, а потім зафар­бувати хромосоми фарбою Гімзи, то у них виявиться чітке диференціювання на темно і світло зафарбовані смуги — диски. Послідовність розташування цих дисків, їхній малюнок строго спе­цифічний для кожної хромосоми. У ре­зультаті різних варіантів методу вда­ється виявити центромерний і біля-центромерний гетерохроматин (С-диски), диски, які розташовані вздовж хромосоми (власне Гімзи-диски, С-диски).

Значний вклад у вивчення хромосом зроблений російськими цитогенетика­ми О. О. Прокоф'євою-Бельговською, О. Ф. Захаровим. В Інституті медичної генетики АМН СРСР О. Ф. Захаровим був розроблений перспективний метод вивчення хромосом. В його основу по­кладено процес неодночасної репліка­ції хромосом: одні ділянки реплікують-ся раніше, у інших цей процес затри­мається і реплікація відбувається знач­но пізніше. Неодночасно іде процес спіралізації хромосом, які вступають у мітоз. Проте до того моменту, коли хромосоми вступають у метафазу, всти­гає завершитись процес вирівнювання цих відмінностей, і ступінь конденсації метафазних хромосом стає однаковим. Було показано, що можна затримати цей процес шляхом введення 5-бромде-зоксиуридину (5-БДУ), який є анало­гом тимідину— попередника ДНК. Як­що 5-БДУ вводити в кінці 5-періоду, то він включається у синтез ДНК; ті ділянки хромосом, де знаходиться ця речовина, залишаються мало зафарбо­ваними, бо була затримана спіраліза­ція. Інтенсивно зафарбовуються ділян­ки (Р-диски), у яких процес репліка­ції відбувся рано і вони встигли спіралізуватися. Розташування світлих і темних дисків при цьому методі проти­лежне тому, що спостерігається при С-фарбуванні.

Порівняльний аналіз різних методів фарбування показав, що один і той же диск може виділятися як світлий, не­зафарбований або темнозафарбований, але порядок розташування дисків іден­тичний при всіх методиках (О-, С-, О-, Р-диски). Отже, не викликає сумніву, що їх розташування і послідовність мають закономірний характер, специ­фічний для кожної хромосоми (див. мал. 2,8). Природа цієї специфічної диференціації хромосом на диски ще повністю не з ясована, як і причини акрихінової флуоресценції ділянок хромосом. Припускають, що це пов'я­зано з наявністю у молекулі ДНК пов­торюваних блоків певної послідовності нуклеотидів або з особливостями зв'яз­ку ДНК з білками, що входять до складу хромосоми. З'ясування внут­рішньої структурної неоднорідності хромосом відіграло важливу роль у подальшому розвитку цитогенетики людини і покладено у основу міжна­родної номенклатури.

Якщо порушення виникають у стате­вих хромосом, то діагностика спрощу­ється. У цьому випадку проводиться не повне каріотипування, а застосо­вується метод дослідження статевого хроматину у соматичних клітинах.

Статевий хроматин—це не­велике дископодібне тільце, яке інтен­сивно фарбується гематоксиліном та іншими лужними барвниками. Воно виявляється у інтерфазних клітинних ядрах ссавців і людини, безпосередньо під ядерною мембраною. Статевий хроматин виявили вперше у 1949 р. М. Барр і Ч. Бертрам у нейронах кіш­ки; дослідники звернули увагу, що він є тільки у ядрах клітин самок і відсут­ній у самців.

Згодом було уточнено, що статевий хроматин є у більшості клітинних ядер самок (60—70 %), у самців його звичайно немає або зустрічається ду­же рідко (3—5 %). У клітинах чолові­ків іноді можна бачити дуже невелику кількість несправжніх тілець статевого хроматину—це конденсовані ділянки аутосом і спіралізовані У-хромосоми. Вони значно менші від X-хроматину і відрізняються за формою, розташуван­ням і кількістю. Статевий хроматин являє собою спіралізовану X-хромосо­му, яка у жінок інактивується ще у ранньому ембріогенезі до розвитку статевих залоз. Інактивацією однієї з X-хромосом вирівнюється баланс генів статевих хромосом у клітинах організ­мів чоловічої і жіночої статі.

Статевий хроматин можна визначи­ти у будь-яких тканинах. Частіше всьо­го досліджуються епітеліальні клітини слизової оболонки щоки (буккальний зскрібок). Це особливо зручно при ма­сових дослідженнях.

У каріотипі нормальної жінки є дві X-хромосоми, і одна із них утворює тільце статевого хроматину. Кількість тілець статевого хроматину у людини та інших ссавців на одиницю менша, ніж число Х-хромосом у даної особини. У жінок, які мають каріотип ХО (мо-носомія-^, синдром Шерешевського — Тернера), ядра клітин не мають стате­вого хроматину. При синдромі трисомії -X у жінки утворюються два тільця, у чоловіка з каріотипом 47 (ХХУ) — є одне тільце (як у нормальних жінок).

Статевий хроматин можна визначи­ти і на мазках крові, у ядрах нейтрофі-лоцитів; вони мають характерний виг­ляд барабанних паличок, які відходять від складно-дольчастого ядра цих лей­коцитів. У нормі у жінок ці структури виявляються у 3—7 % нейтрофілоцитів, у чоловіків вони взагалі відсутні. Де­які автори вважають, що цей метод більш достовірний, ніж буккальний зскрібок, але внаслідок великої трудо­місткості він використовується тільки при спеціальних дослідженнях.

Визначення статевого хроматину ви­користовують і у судовій медицині, ко­ли необхідно за плямами крові встано­вити статеву належність, при аналізі, коли необхідно встановити, чоловікові чи жінці належить знайдена частина трупа, навіть через тривалий термін після смерті.